Muzium Kota Johor Lama merupakan sebuah muzium yang diletakkan di bawah pentadbiran Jabatan Muzium Malaysia (Wilayah Selatan). Pembinaan muzium ini bermula pada bulan Ogos 2004 dan siap sepenuhnya pada bulan Februari 2007. Muzium ini mula dibuka kepada umum pada bulan Oktober 2007. Rekabentuk bangunan muzium ini bercirikan bentuk rumah tradisional. Muzium ini merupakan satu-satunya muzium yang dibangunkan secara ‘insitu’ di suatu kawasan yang pernah melakar sejarah penting dalam perkembangan sejarah negara.
Fungsi utama penubuhan muzium ini adalah untuk memberikan maklumat dan gambaran yang lebih jelas kepada mereka yang mencintai sejarah untuk mengetahui dengan lebih mendalam peranan Kota Johor Lama yang pernah menjadi pusat pemerintahan kerajaan Melayu yang penting selepas era kejatuhan Kesultanan Melaka pada tahun 1511. Kesinambungan warisan kegemilangan Kerajaan Melayu Melaka terus bertapak di negeri Johor dan telah mewarnai sejarah tempatan ketika itu terutamanya di sepanjang Sungai Johor. Episod ini turut memainkan peranan yang penting dalam pemerintahan Johor.
Ruang pameran di dalam muzium ini terbahagi kepada beberapa segmen bermula dengan pengenalan Kota Johor Lama sehinggalah kajian-kajian arkeologi yang telah dijalankan di dalam kawasan kota ini oleh penyelidik tempatan dan luar negara.
